siRNA“三保一”套餐内容：（HPLC纯化 ）
|
产品说明 |
规 格 |
纯化方式 |
||
|
目的基因的siRNA oligos |
3靶点 |
2 OD |
HPLC |
|
|
阴性对照siRNA oligos |
1条 |
1 OD |
HPLC |
|
|
FAM标记阴性对照siRNA oligos |
1条 |
0.5 OD |
HPLC |
|
|
RNAi阳性对照siRNA oligos |
1条 |
0.5 OD |
HPLC |
|
|
套餐价格 |
1500元 |
|||
常见问题
|
实验问题 |
原因 |
推荐解决方法 |
|
siRNA转染靶细胞后qPCR检测干扰效果不佳？ |
1）转染效率低 2）本底表达丰度过低 3）转染条件不佳 |
1） 调整细胞状态,选择合适的转染试剂,可使用NC-FAM优化转染条件,转染效率要求在80%以上,转染效率低的考虑用慢病毒或腺病毒介导。 2）本底表达丰度过低干扰效果会很不明显。建议更换细胞筛选靶点 3）调整siRNA与转染试剂的比例。 |
|
siRNA转染靶细胞后WB检测干扰效果不佳？
|
靶蛋白的半衰期长
|
延长干扰收样时间或改用病毒介导或进行稳转筛选。
|
实验注意事项：
1）本底表达检测：强烈建议做RNAi实验之前做一下目的基因的本底表达的检测，如果细胞内目的基因的表达量本身就非常低，不用敲就非常
非常低的基因，CT值30以上的基因几乎就不表达，不建议做RNAi
2）关于筛选：根据我司多年的经验，对于大部分的细胞，第一次筛选可以在12孔板，设置50nM的终浓度，转染三条siRNA和对照做筛选。
初筛没必要用太多量的细胞（有同学直接在6cm 皿里筛选，多浪费啊），也不用设置太多的浓度梯度和时间点等条件去优化。如果第一轮靶点敲减
效率达不到50%，可以再根据第一轮的实验结果，以敲减效率最高的靶点，进行浓度/收样时间/转染试剂比例
等条件去优化。
3）关于阳参：阳参的siRNA片段，是我司验证的已经文献支持的靶点序列。对于第一次做RNAi实验的同学，可以拿阳参练手。把细胞培养，转
染，定量等体系过一遍再去做正式实验。因为你很可能细胞养的很挫，转染试剂不合适，RNA抽提不好，反转录定量的体系不好，，，，，，
4）关于转染 ：买个好的转染试剂。RNAimax/lipo3000/fugene等等。
siRNA使用说明书
产品简介：
常规化学合成 siRNA小分子RNA,已经经过纯化、退火等处理，只要用 DEPC 水溶解并配制成 20µM液体即可直接转染细胞。产品剂型为冻干粉，产品剂量经过严格测算，以摩尔数或者OD标明(1OD=3nmol≈40ug,以下内容都以摩尔数计算)。
保存和使用：
运输保存：
产品以冻干粉的形式，常温运输，常温下一两周内稳定。收到产品后，请于-20℃至-80℃保存。 液体剂型：siRNA的贮存浓度一般为20µM，应避免反复冻融避免反复冻融(尽量不要超过5次)，建议溶解后的产品分装保存分装保存分装保存，-20℃~ -80℃保存期不超过6个月。如果近期不做实验，产品需长期放置，最好以冻干粉形式保存。 冻干粉剂型在 -20℃~-80℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集于管底，再用DEPC水或灭菌 ddH2O，配制成20µM的液体剂型。
表2 20μM储存液的配置参考
|
siRNA(nmol) |
0.25 |
0.5 |
1 |
2 |
5 |
10 |
|
溶解体积(μl) |
12.5 |
25 |
50 |
100 |
250 |
500 |
使用前须知
为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法
为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：
siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
以lipofectamine™2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50% (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2) 对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：
注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。
3) 将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400μl培养基(v2)的培养孔中，轻轻混匀；
4) (可选)培养4~6h后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基；
5) (可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理)；
6) 将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h (培养时间与实验目的相关)。
表3 siRNA用量参考v1：Opti-MEM®I (无血清、无抗生素，转染专用)；v2：完全或不完全培养基
|
培养板 |
每孔中总体积(v1+v1+v2) |
siRNA终浓度 |
siRNA储存液 |
lipo2000 |
DNA共转染† |
|
96-well |
100μl (25μl+25μl+50μl) |
100nM |
0.5μl |
0.25μl |
10~100ng |
|
|
100μl (25μl+25μl+50μl) |
50nM |
0.25μl |
0.25μl |
10~100ng |
|
|
100μl (25μl+25μl+50μl) |
30nM |
0.15μl |
0.25μl |
10~100ng |
|
|
100μl (25μl+25μl+50μl) |
20nM |
0.1μl |
0.25μl |
10~100ng |
|
|
100μl (25μl+25μl+50μl) |
10nM |
0.05μl |
0.25μl |
10~100ng |
|
24-well |
500μl (50μl+50μl+400μl) |
100nM |
2.5μl |
1μl |
100~200ng |
|
|
500μl (50μl+50μl+400μl) |
50nM |
1.25μl |
1μl |
100~200ng |
|
|
500μl (50μl+50μl+400μl) |
30nM |
0.75μl |
1μl |
100~200ng |
|
|
500μl (50μl+50μl+400μl) |
20nM |
0.5μl |
1μl |
100~200ng |
|
|
500μl (50μl+50μl+400μl) |
10nM |
0.25μl |
1μl |
100~200ng |
|
12-well |
1mL (100μl+100μl+800μl) |
100nM |
5μl |
2μl |
200~400ng |
|
|
1mL (100μl+100μl+800μl) |
50nM |
2.5μl |
2μl |
200~400ng |
|
|
1mL (100μl+100μl+800μl) |
30nM |
1.5μl |
2μl |
200~400ng |
|
|
1mL (100μl+100μl+800μl) |
20nM |
1μl |
2μl |
200~400ng |
|
|
1mL (100μl+100μl+800μl) |
10nM |
0.5μl |
2μl |
200~400ng |
|
6-well |
2mL (250μl+250μl+1500μl) |
100nM |
10μl |
5μl |
500~1000ng |
|
|
2mL (250μl+250μl+1500μl) |
50nM |
5μl |
5μl |
500~1000ng |
|
|
2mL (250μl+250μl+1500μl) |
30nM |
3μl |
5μl |
500~1000ng |
|
|
2mL (250μl+250μl+1500μl) |
20nM |
2μl |
5μl |
500~1000ng |
|
|
2mL (250μl+250μl+1500μl) |
10nM |
1μl |
5μl |
500~1000ng |
*：实验参考用量示例; †：当实验涉及DNA共转时参考
转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。
1) RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。注：引物设计质量很重要；
2) 蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western-blot等。检测时间受细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样；
3) 功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。
注意事项：
FAM是一种绿色荧光基团，由蓝光激发，激发波长480nm，发射波长520nm。FAM-siRNA的转染过程和普通siRNA是一样的，注意整个实验过程要尽量避光，建议转染时室内和超净台内不要开灯。转染6小时后即可检测转染效率：流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等均可。
如果您订购的是我司设计合成的“三保一套餐”产品，反馈实验结果时请务必提供FAM-siRNA组转染的荧光和白光图片，阳性参考组的敲减数据，及Target siRNA组定量PCR的敲减结果。
| 1.质量保证 | 2.发货时间 | 3.售后处理 |
| 我司产品发货前均经过质量检测，确保您收到的产品质量准确无误！ | oligobio拥有大量的现货产品，本公司的现货产品从订货日期起一周以内即可到货，大大缩短了您的等待时间！另外oligobio的快速克隆及病毒包装平台也能让您体验到前所未有的快速定制服务！ | oligobio所售出的产品全部登记在册，如果您拿到我们的产品觉得和实质不相符或存在问题，您只需要告诉我们相关产品信息我们会迅速做出反应，为您提供解决方案 |
| 4.订购流程 | 5.联系我们 | 6.相关服务： |
| 联系我们→技术人员或销售人员与您沟通→签订合同→支付预付款→执行项目→确认收货→支付尾款→售后服务 | oligobio提供免费的技术咨询，任何关于产品或者技术问题，都可以联系我们们。 免费热线：13321116807 服务邮箱：wangyuteng@oligobio.com.cn |
基因合成，亚克隆构建，3‘UTR验证实验 启动子合成及验证，慢病毒包装 腺病毒包装。腺相关病毒包装 稳转株构建 |