慢病毒包装试剂盒
发布时间：2019-08-31 浏览次数： 次
产品简介
欧林格生物慢病毒包装试剂盒，对包装系统进行了优化，增加了我司特有的慢病毒出毒增强液。相同的包装量，相比较实验室常规的包装体系能增加3-10倍的出毒量，让您的病毒包装简单快捷，让初学者也能快速包装高滴度的慢病毒。试剂盒的组分包含包装质粒、转染试剂、慢病毒出毒增强剂等。适用于基因过表达和干扰慢病毒的包装，以及后续稳定细胞株的构建。
客户只需构建骨架质粒，和试剂盒中的包装质粒Easy Mix按1：1混合，用LipoX Transfection Reagent将混合后的质粒转染293T细胞，8h就能看到荧光，48h就能收获高滴度的慢病毒，利用慢病毒浓缩液或者超滤柱能快速浓缩纯化病毒，为后续的感染实验提供高纯度高滴度的病毒。
试剂盒组成：
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组分名称 |
储存 |
产品编号/规格 |
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10T |
20T |
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（1）Easy Mix |
-20℃ |
75μl |
150μl |
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（2）转染增强剂 |
-20℃ |
300ul |
600ul |
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（3）LipoX Transfection Reagent |
4℃ |
375ul |
750ul |
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（4）EGFP对照质粒（Amp+） |
-20℃ |
25μg |
50μg |
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（5）出毒增强培养基 |
4℃ |
475ml |
950ml |
慢病毒包装经验总结
1.质粒质量
1）260/280 比值1.8左右
2）浓度800-1000ng/ul 以上
3） 跑胶鉴定 无RNAse 污染
4）超螺旋比例在90%以上
我们的包装质粒无内毒素抽提后，经过了病毒包装测验，原液出毒效率达到1E+7TU/ml.
2. 细胞状态
1）细胞状态良好健康，无支原体，细菌，真菌等污染。
为什么有的实验室细胞传着传着就状态就不好，需要从头养一支。据称有的人为了夸赞自己的包装细胞，说隔一段时间就从ATCC 购买一支新的。这在我看来很扯淡。ATCC的细胞从哪里来？大部分是从研究所搜集而来。从源头讲，ａｔｃｃ拿到的细胞也不知道建株后多少代了，那么强调多少代的意义何在？大概率是因为自己养细胞水平差，养着养着细胞状态挫了。只要是状态好的时间冻存的细胞，都有媲美ATCC细胞的质量。
3. 转染效率
有了好的质粒,好的细胞状态,还要匹配好的转染试剂,我司配套的转染试剂,毒性小,转染效率高.
慢病毒包装流程图：
一、慢病毒包装操作步骤：
1）转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X107细胞/20ml，接种于10cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养16h待细胞密度达70%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2）转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3）向一灭菌离心管中加入重组骨架载体（5ug），包装载体MIX（5ug）共计10ug，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育5分钟。
4）将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取40μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与相应体积的Opti-MEM混合，调整总体积为1ml，在室温下温育5分钟。
5）把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
6）混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7）将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。
8）培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入1ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9）每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基10ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。
10）收集上清液，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μmPVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。
11）4℃，50000g 高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
12）小心弃去上清，晾干，按200ul/10cm培养皿的量加入PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀（避免产生气泡），继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80 ℃冰箱保存。
二 慢病毒生物学滴度测定操作步骤：
1）在滴度测定前一天取48孔板，加入3X104cell/孔HEK 293细胞。
2）用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。具体做法如下：取96孔板，每孔含有90ul培养基，第一横排孔每孔加入10ul待测病毒原液，混匀后吸取10ul混合液至第二横排孔（混匀时尽量不要产生气泡），如此稀释至第六横排孔。
| 滴定量 | 1μL | 0.1μL | 0.01μL | 0.001μL | 0.0001μL | …… |
| 病毒液 | 5or10 | 10 | 10 | 10 | 10 | …… |
| DMEM完全培养基 | 45or90 | 90 | 90 | 90 | 90 | …… |
| 上样量 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | …… |
注意：每次移液都必须换用新的枪头，否则就会将枪头外面的病毒带入到下一孔，导致过高估计滴度的终点。
3）吸10ul病毒混合液加入到相对应的48孔板中。
4）经72小时感染，借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察），在最高稀梯度m的孔数出N（N<10）个带荧光的细胞,则病毒滴度为Nx10m/ul（m为稀释倍数），即病毒滴度为Nx10m+3TU/ml，若N>10，则需继续稀释。(如果病毒荧光较弱可加入polybrene以便增强病毒感染细胞的能力)
